Commun Biol︱刘晓冬/樊瑜波/李小梅揭示钙通道CaV1编码多肽对神经元活动—突起发育耦联的调控作用
撰文︱杨亚雄，刘晓冬
责编︱王思珍
制版︱查佳雪
L型电压门控钙离子通道（L-type Voltage-gated Calcium Channel，CaV1）作为介导细胞钙信号的重要膜蛋白，在神经系统中广泛表达，是神经元发育、可塑性、学习与记忆等过程的关键分子机制之一，也与神经退行性疾病等多种精神障碍密切相关[1-3]。CaV1通道是由多个亚基蛋白组装而成的分子机器，根据主亚基分为四种亚型（CaV1.1-1.4），具有24次跨膜片段以及长达700氨基酸的长碳端。长碳端的远段（distal C-Terminus，DCT）能够与apoCaM（无钙钙调素蛋白，促进通道开放）竞争，从而削减通道的钙内流，其作用类似于在生物酶中常见的自抑制[4, 5]。据推测，某些膜蛋白的长碳端系由整合细胞内的功能蛋白进化而来[6]；事实上，CaV1 DCT也的确可以通过蛋白水解酶剪切、外显子隐藏启动子转录等机制，在细胞中产生独立多肽并发挥生理功能。此前DCT多肽的研究基本上局限于单一亚型及单一变体，得出的零散结论之间常常存在令人困扰的差异甚至矛盾，定量的、系统性的刻画和分析应有助于问题的澄清。例如，CaV1.2 DCT肽能够以转录因子方式调控关键基因表达，对神经元突起生长产生促进作用[7]；然而，源自CaV1.3等亚型的多种DCT肽均已展现出同“自抑制”一致的效应：削弱通道钙内流[8-10]，提示DCT肽是神经元钙通道活动-突起发育耦联潜在的抑制因子。从进化角度看，四种通道亚型有着紧密的亲缘关系，在门控机制等诸多方面本质上趋同、定量上存异。因此，本工作设定的中心任务是：证明多种多样DCT变体间的差异和矛盾只是表面现象，进而揭示神经元DCT多肽的真实效应和共有规律。
2022年5月19日，北京航空航天大学生物医学工程高精尖创新中心/生物与医学工程学院刘晓冬研究组在《通讯—生物学》（Communications Biology）在线发表题为“Cytosolic peptides encoding CaV1 C-termini downregulate the calcium channel activity-neuritogenesis coupling”的研究论文。北航杨亚雄副教授、在读博士生于振和耿金丽为本文的共同第一作者，北航刘晓冬教授和樊瑜波教授、以及清华大学李小梅教授为共同通讯作者。该研究针对CaV1通道基因编码的DCT多肽进行了系统分析，定量刻画了多种变体共有的效应和机制，首次揭示了DCT多肽对于神经元“钙通道活动-突起发育耦联”的抑制作用和稳态调控。
CaV1 DCT抑制通道钙内流，为了探查DCT编码多肽对钙通道介导的兴奋-转录耦联及相应神经元生长发育（以下简称神经元钙通道活动-突起发育耦联）的作用，作者首先将具有超强通道抑制能力的CaV1.4 DCT多肽（DCRDF）在离体培养的皮层神经元中表达，并记录到其对神经元CaV1电流显著的抑制能力，该抑制效果呈现出峰值电流降低（Peak ICa），终末态电流（300 ms钙电流，I300）保持不变的特性（图1a），与之前报道的碳末端抑制（CMI，即）效应一致[8]。作者进一步考察了DCRDF对神经元发育的影响（图1b-d）。结果提示，DCT肽可有效抑制兴奋-转录耦联（以转录因子CREB的磷酸化水平（图1c）及下游关键蛋白c-Fos的表达水平为指标（图1d）），进而抑制神经元突起发育（图1b）。单点突变体DCRDF_V/A丧失了对通道的抑制能力，作为阴性对照进一步证明了DCRDF多肽对神经元钙通道活动-突起发育耦联的抑制。
图1 CaV1.4 DCTF多肽抑制神经元钙通道—突起发育耦联
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
多种DCT多肽变体散见于已发表文献中，天然存在于神经元及心肌细胞中并产生效应。图1基于CaV1.4 DCT的结果与文献报道（以CaV1.2 DCT为主）不尽相同，甚至有矛盾之处。为了进一步全面厘清CaV1 DCT的效应，作者选取了三种典型的内源性CaV1 DCT肽，分别为：CaV1.2独立启动子表达长肽（CCATC），CaV1.2及CaV1.3编码的中等长度肽（即CCTC、CCTD，可通过水解酶剪切产生），以及DCT末端的关键结构域DCRDC和DCRDF编码的短肽，共计构建了五种DCT肽（图2a），并利用膜片钳电生理测量了CaV1.3通道的抑制效应（图2b）。结果表明，除CCATC外，其余四种多肽变体对钙通道展现出显著的抑制作用（图2c）。
图2 多种代表性DCT肽对钙通道门控的抑制效应
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
作者进一步探究了五种多肽对神经元发育的影响，却发现仅DCRDC和DCRDD两种碳末端片段对神经元具有抑制功能（图3a-c）。考虑到部分DCT变体曾被报道具有在细胞质和细胞核中穿梭的能力[7]，作者考察了五种DCT多肽在细胞中的分布，发现CCATC、CCTC和CCTD三种多肽偏向定位于细胞核，而DCRDC和DCRDD基本滞留在细胞质中（图3d）。两类多肽的核/质定位与其是否包含核定位序列（NRD，见图2a）密切关联。对神经元钙通道而言，CCATC、CCTC和CCTD三种多肽在细胞质中才有可能直接施加于通道并发挥抑制效应。因此，作者重新统计了偏向于胞质分布多肽的神经元，发现CCTC和CCTD组呈现出显著抑制效果，CCATC组则与对照组没有显著性差异（图3e-f）。综合起来，五种多肽对神经元突起生长的效应与通道抑制能力（CMI）具有良好的相关性（图3g），表明DCT多肽在神经元细胞质时可依据抑制钙通道的能力下调神经元突起的发育水平。
图3 细质分布DCT多肽依据CMI能力调控神经元发育水平
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
上述结果中，CCATC为何没能抑制通道还不得而知。作者注意到CCATC较其它CaV1.2编码多肽变体多出一个完整的PCRDC结构域，由此推测PCRDC可能导致CCATC失去抑制能力。CaV1通道四种亚型均包含PCRD和DCRD两个结构域，文献中相关的研究零散且不一致。作者利用膜片钳技术测试了全部四个CaV1亚型编码的DCRD和PCRD对于CMI（抑制通道功能）的贡献；同时，利用蛋白-蛋白定量FRET方法测量了多肽与apoCaM的竞争能力（即与通道apoCaM结合域的亲和力Kd）。结果表明，四种DCRD均具显著抑制通道的能力，与多肽-通道亲和力（Kd）次序一致，从CaV1.1到CaV1.4逐渐增强（图4a-c）；另一方面，四种PCRD的通道亲和力/抑制强度有较大差异，CaV1.1和CaV1.2通道（PCRDS和PCRDS）明显弱于CaV1.3和CaV1.4（PCRDD和PCRDF）（图4d-f），该结果也首次为CaV1.1和CaV1.2通道CMI较弱、CaV1.3和CaV1.4通道CMI较强提供了定量的刻画和机制线索。对于神经元CaV1通道，由于CCATC包含PCRDC，导致最终的CMI效应微弱，来自PCRDC-DCRDF等多肽变体的结果也符合预期，进一步支持了作者提出的CMI-Kd量化曲线（图4g）。这一曲线普适于已知和未来的DCT多肽，为相关方向的后续研究提供了基础数据。
图4 四种CaV1通道亚型编码DCRD和PCRD的CMI强度分析
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
本工作所发现的DCT肽对钙通道—神经突起发育的抑制效应，表面上似与文献中早先报道的DCT作为核转录因子的效应相矛盾，因为后者明确促进神经元发育[7]。作者提出科学假设：DCT多肽的效应高度依赖其核-浆分布，即DCT在细胞质中通过CMI效应抑制神经元发育（图3）；而细胞核DCT直接调控关键基因转录而促进神经元发育。为检验此假设，作者首先分类考察了过表达CCTD的神经元，依据多肽核质分布比例将神经元划分为“胞质优势”和“核优势”两组。与预期一致，胞质CCTD显著抑制神经元发育，而细胞核CCTD则有效促进神经元发育（图5a-c）。进一步地，作者分别利用核定位序列（NLS）和核输出序列（NES）将CCATC和CCTC严格限制在细胞核或细胞质中，再次确认了DCT多肽依核-浆分布对突起生长施加相反的效应（图5d-h）。
考虑到CCATC、CCTC和CCTD三种多肽变体的抑制能力明显不同而促进生长能力相近，但对神经元发育的综合效应不明显（图3），提示神经元自身可能具备调控DCT多肽核-浆分布的能力。为此，作者进一步考察了核质比与CMI强度的关系（图5i-j），发现强CMI多肽CCTD偏向在细胞核分布，而弱CMI多肽CCATC则相对偏向细胞质，CCTD单点突变CCTD_V/A降低CMI的同时，其分布也倾向于细胞质。根据以上数据和分析，作者提出：DCT多肽基于核-浆分布双向调控神经元发育，同时多肽对于通道的抑制效应也影响着核-浆分布，动态调控神经元突起的生长。
图5 DCT多肽基于核-浆分布双向调控神经元发育
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
神经元DCT多肽又是如何依据CMI强度调控自身亚细胞分布的呢？文献报道，介导DCT核-浆的NRD结构域响应钙刺激而出核[7]。作者由此猜想，分布于神经元胞浆中的DCT多肽，对CaV1通道产生抑制（CMI）效应，相应钙内流的减少被NRD机制感知，下调核定位（即出核，更倾向胞浆定位）。实验中，利用CaV1通道特异的DHP抑制剂（Nifedipine）阻断钙内流，在此条件下，CCTD多肽显著偏向于在细胞核中表达；进一步地，在神经元中过表达DHP结合位点突变的CaV1通道（DHP-通道），以消除DHP阻断（内源CaV1）的影响。与预期一致，CCTD的分布也恢复至对照组神经元正常状态（图6a-b）。利用这一实验体系，作者构建了三种DCT变体（即不同CMI强度）的DHP-通道，在高浓度Nifedipine条件下，考察CMI对多肽亚细胞分布的变化，作者发现，在表达强CMI通道的神经元中CCTD倾向于细胞核分布，而对于弱CMI通道CCTD倾向于细胞质分布（图6c-d）。上述结果表明，神经元DCT肽对CaV1钙内流敏感，其核-浆分布受CMI效应强度密切调控。
图6 CaV1.3通道的实际CMI强度对DCT多肽的核-质分布至关重要
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
图7 工作总结图：CaV1 DCT编码多肽调控钙通道活动—神经元突起发育耦联
（图源：Yang Y, et al., Commun Biol, 2022）
综上所述，横跨CaV1家族，该研究系统考察了DCT编码的系列多肽变体，并聚焦于皮层神经元和CaV1.3亚型，揭示了DCT多肽对钙通道活动—神经元突起成长耦联的调控作用及相关机制（图7）：
（1）DCT多肽通过结合CaV1通道的apoCaM结合域对通道钙内流及其下游信号通路（突起发育）产生抑制；
（2）关键结构域PCRD及DCRD决定多肽的CMI强度，并与通道上的DCT结构域共同决定最终的抑制效果；
（3）胞浆分布DCT多肽抑制CaV1通道及突起生长，核内分布DCT多肽直接促进突起生长；同时，胞浆DCT通过抑制通道钙内流影响自身的核-浆分布，实现对突起生长过程的动态调控。
总之，DCT多肽结合并抑制CaV1通道功能，下调一系列关键信号节点或事件：CaV1通道的开放，通道导向核的信号，调控突起生长的基因转录，以及钙敏感的DCT出核。
此项研究在方法学上的关键策略是利用具有代表性的系列多肽：囊括所有CaV1亚型及主要DCT变体类型，并将结果总结为CMI-Kd曲线/方程等定量关系。在多事件复杂信号通路的研究中，无遗漏全面严格检验所有节点的信号是不现实的，通过降低标准和严谨性以增加节点数目在实践中常被采用，作者权衡之后决定另辟蹊径：选取钙通道门控及突起生长这两个关键节点，充分利用其高量化水平（通道门控分析和神经元生长形态学分析），结合多个多肽形成的宽范围亲和力梯度，定量检验各级科学假设，增加结论的可靠性和说服力，同时也有助用提高科学发现的适用范围、辅助厘清领域内不一致的数据和结论。本项研究作为上述方法的成功案例，为各领域的信号通路研究提供了有益的启示。
对于钙通道活动—突起生长耦联的调控，目前已知简单上调（如Bay-K-8644）或下调（如Cd2+）钙通道电流并不能确保对耦联通路的相应调控。所以本工作的胞浆定位DCT为领域提供了一系列具有确定表型和机制的抑制多肽。
对于神经元内源性DCT多肽，作者在验证文献中CaV1.2 DCT的基础上，首次提供了CaV1.3 DCT多肽及其潜在产生机制的相关证据，所获得的证据支持内源性多肽与过表达DCT遵守类似的调控规律，但仍需后续的深入研究加以确认。
DCT代表了一类重要功能片段或结构域：类（apo）CaM蛋白，二者功能上相近，DCT可以与apoCaM直接竞争。迄今为止，DCT的精细结构尚未得到解析，现在线索提示DCT与apoCaM结构可能类似，如PCRD和DCRD呈主从协同关系与靶蛋白结合，与CaM的N端/C端类似。因此，此工作将有助于未来DCT乃至其它类apoCaM蛋白的结构-功能研究。
越来越多的证据支持CaV1通道与帕金森症、阿兹海默症、精神分裂等多种脑疾病存在显著关联，而DCT多肽是否及如何参与上述疾病过程还有待后续的研究，本工作为CaV1通道相关疾病研究提供了新颖视角，是未来的创新方向之一。
本研究得到了国家自然科学基金（81971728，21778034，11902021, U20A20390，11827803）和北京市自然科学基金（7191006, 5204037）的支持。
杨亚雄（左一）、于振（左一）、耿金丽（右二）为共同第一作者，刘晓冬（右一）为通讯作者
（照片提供自：刘晓冬实验室）
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参考文献（上下滑动阅读）
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本文完